奥拉帕尼/利普卓对不同OC细胞系的细胞毒性作用

  延长奥拉帕尼(利普卓)对不同OC细胞系的细胞毒性作用是由不同的DNA损伤修复和凋亡/自噬激活介导的。我们第一次证实了微分奥拉帕尼(利普卓)治疗对OC细胞系的影响取决于BRCA状态,通过执行一个剂量-时间曲线评价细胞生存能力通过MTT测定BRCA1-nullUWB1.289细胞系(超宽频)UWB1.289+BRCA1细胞(UWB-BRCA),BRCA1表达永久恢复,和BRCA野生型SKOV3细胞线。正如预期的那样,没有BRCA1的UWB细胞对奥拉帕尼(利普卓)的敏感性高于BRCA1恢复的UWB-BRCA细胞和BRCA野生型SKOV3细胞。  

奥拉帕尼,利普卓

  奥拉帕尼(利普卓)通过抑制PARP蛋白,迅速诱导DNA损伤,这可以通过在3个细胞系中24h的表达量测定。特别是,经过长时间奥拉帕尼(利普卓)治疗(144h)后,通过免疫荧光(IF)和Westernblot分析,证实仅在DNA修复受损的细胞(UWB细胞)中存在DNA损伤。对三种细胞系的细胞周期分析显示,奥拉帕尼(利普卓)处理后,在G2期(4n)细胞周期出现明显的阻滞,在G1期(2n)和S期细胞百分比均出现相应的下降,UWB和UWB-brca细胞的下降尤为明显。与这一观察结果一致的是,暴露于奥拉帕尼(利普卓)的细胞,特别是UWB和UWB-brca细胞中,CyclinB1(一种G2/m调节蛋白)的表达增加。  

  在评估延长奥拉帕尼(利普卓)处理(144h)对集落形成效率的影响时,我们观察到奥拉帕尼(利普卓)显著抑制了BRCA缺失的UWB细胞的克隆能力,而对BRCA野生型SKOV3细胞没有影响,这与预期一致。然而,有趣的是,在UWB-BRCA细胞中,较高剂量的奥拉帕尼(利普卓)实现了部分抑制。  

  这些数据证实了之前观察到的奥拉帕尼(利普卓)的影响,但也指出了延长奥拉帕尼(利普卓)治疗UWB-BRCA细胞的部分疗效。因此,我们研究了UWB-BRCA细胞对奥拉帕尼(利普卓)处理的不同反应是否是由于不同的细胞内通路的诱导所致。我们通过AnnexinA5FITC/7-AAD双染色流式细胞术检测细胞凋亡的诱导。与模拟对照细胞相比,奥拉帕尼(利普卓)(5×M)处理uwt-brca和SKOV3细胞系144h后,未显著增加早期或晚期细胞凋亡的百分比。事实上,奥拉帕尼(利普卓)的治疗导致了UWB细胞凋亡的持续增加(从DMSO的约10%到5个奥拉帕尼(利普卓)的约21%)。因此,AnnexinA5FITC/7-AAD双染色证实奥拉帕尼(利普卓)的细胞毒作用仅在超wb细胞中明显。此外,Westernblot分析显示,两种剂量的奥拉帕尼(利普卓)处理后,只有在UWB细胞中,caspase-3和PARP1的裂解/激活都非常明显,与流式细胞仪分析的数据一致。 

  由于PI3K/AKT分子通路是参与细胞存活和凋亡的关键信号,我们还通过Westernblot分析评估了AKTSer473位点磷酸化的激活情况。2b2b,AKT蛋白磷酸化水平(phAKT)在治疗奥拉帕尼(利普卓)SKOV3细胞未受影响,并显著减少剂量依赖性的方式在超宽频细胞,同时AKT总水平持平,这证实了核心作用的一种蛋白激酶信号转导通路奥拉帕尼(利普卓)-mediated细胞死亡。有趣的是,用奥拉帕尼(利普卓)处理UWB-BRCA细胞导致了phAKT表达的显著下调,而cleavedCaspase3和cleavedPARP1的表达却没有上调。  

  由于AKT是自噬的关键抑制剂,我们研究了在UWB-BRCA细胞中AKT磷酸化状态的降低是否暗示自噬激活。Westernblot分析了以LC3-I向LC3-II转化和P62蛋白降解为代表的典型自噬特征。我们观察到,在UWB-BRCA细胞中,奥拉帕尼(利普卓)1.5倍或5倍水M处理的LC3-II/LC3-I比值显著升高(分别为2.3倍和2.5倍)。  

  P62蛋白的降解也证实了自噬的激活(分别为0.7倍和0.3倍)。相反,UWB和SKOV3细胞对LC3-II/LC3-I比值和P62没有显著的调节。为了研究自噬在parpi耐药中的作用,我们评估了自噬抑制剂氯喹(CQ)存在或不存在时奥拉帕尼(利普卓)对细胞凋亡的诱导作用。CQ诱导UWB和UWB-brca细胞系中LC3-II和P62的积累,这反映了自噬抑制作用。奥拉帕尼(利普卓)和CQ联合治疗未诱导UWB-brca细胞凋亡激活,并显著降低UWB细胞中凋亡标志物cleavedCaspase3和cleavedPARP1的表达。这些结果表明,在OC细胞系中,自噬并不代表一种细胞保护反应,而是有助于奥拉帕尼(利普卓)的细胞毒性作用。如何购买奥拉帕尼?详情请扫码咨询:

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