依鲁替尼/亿珂诱导的神经炎症反应

  为了确定使用依鲁替尼(亿珂)进行的预处理是否会在体内改变LPS诱导的神经炎症,每天对腹腔内(ip)给予依鲁替尼(10 mg/kg)或赋形剂的小鼠连续3天,然后注射LPS或PBS。注射LPS或PBS后三小时,给小鼠灌注并用4%多聚甲醛(PFA)溶液固定,然后快速冷冻大脑组织,并使用低温恒温器(35微米厚)切片。对每个脑切片进行免疫组织化学染色。用PBS冲洗脑切片,并在室温下用含0.2%Triton X-100和0.5%BSA的PBS透化1小时。随后将组织切片与第一抗Iba-1,抗GFAP,抗COX-2或抗IL-1β抗体在4°C下孵育过夜。

依鲁替尼

  第二天,将组织切片用0.5%BSA洗涤3次,并在室温下与生物素偶联的抗兔二抗孵育1小时。然后将切片用0.5%BSA冲洗,并在抗生物素蛋白-生物素复合物溶液中于室温孵育1小时。用0.1 M磷酸盐缓冲液(PB)洗涤切片3次后,通过将切片与0.5 mg/ml 3,-二氨基联苯胺在含有0.003%H2O2的0.1 M PB中孵育来检测信号。将切片用0.1 M PB冲洗并安装在明胶包被的载玻片上,并在明场显微镜(Leica)下捕获图像。使用-评估细胞活力-二苯基溴化四氮唑(MTT)分析。

  将BV2小胶质细胞接种在96孔板中,并在不存在FBS的情况下,用各种浓度的依鲁替尼处理24小时。然后将细胞用0.5 mg/ml MTT处理,并在5%CO2培养箱中于37°C孵育3小时。在580nm处测量吸光度。从1日龄的Sprague-Dawley大鼠的大脑皮层中培养大鼠原代混合神经胶质细胞。简而言之,将皮质在含有10%FBS /青霉素-链霉素溶液(5000单位/ ml青霉素,5mg/ml链霉素)的高葡萄糖DMEM中研磨成单细胞,并铺板放入75 T烧瓶(0.5半球/烧瓶)中放置2周。

  为了收获大鼠原代小胶质细胞,将烧瓶以120 rpm的速度连续摇动2h,以促进小胶质细胞从烧瓶中脱离。随后收集液体培养基,并以1500 rpm离心15分钟,然后将细胞沉淀重悬于板中,每孔培养1××105个细胞。使用0.1%胰蛋白酶收获烧瓶中剩余的细胞以获得原代星形胶质细胞。将这些原代星形胶质细胞和原代小胶质细胞在预先涂有聚-d-赖氨酸的12孔板中培养.BV2小胶质细胞用4%多聚甲醛固定10分钟,用PBS洗涤3次,然后在GDB缓冲液(0.1%明胶,0.3%Triton X-100、16 mM磷酸钠,pH 7.4和450 mM)中与抗CD11b和抗IL-1β或抗CD11b和抗COX-2抗体一起孵育NaCl)在4°C下过夜。

  第二天,将细胞用PBS洗涤3次,并与以下第二抗体在室温下孵育1小时:Alexa Fluor 488偶联的抗小鼠和Alexa Fluor 555偶联的抗兔。将细胞安装在含DAPI的溶液中,并使用共聚焦显微镜从单个平面捕获图像,并使用ImageJ软件进行分析。使用6-10张独立图像以盲法分析样品。为了检查依鲁替尼是否会影响IL-1β水平,我们进行了酶联免疫吸附试验(ELISA)。简而言之,将BV2小胶质细胞用依鲁替尼(500 nM)或溶媒(1%DMSO)处理30分钟,用LPS(100ng/ml)或PBS处理24小时。

  然后使用条件培养基进行IL-1βELISA。根据制造商的建议,使用了小鼠IL-1βELISA试剂盒。重组小鼠IL-1β蛋白用作标准。使用酶标仪在450 nm处测量样品的吸光度。为了确定依鲁替尼是否会影响ERK,P38,JNK和AKT信号传导,将BV2小胶质细胞用依鲁替尼(1μM)或溶媒(1%DMSO)1小时,然后LPS(1μg/ ml)或PBS 45分钟。最后的温育后,将细胞用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂片剂的RIPA缓冲液裂解。如前所述进行蛋白质印迹分析,并使用Fusion软件或ImageJ软件分析图像。如前所述进行伤口愈合分析。简而言之,看到了BV2小胶质细胞。现在依鲁替尼的价格是多少?更多详情可咨询下方微信。

 

温馨提醒:为了战胜疾病,相信所有患者和家属都希望找到香港最好的医院和最权威的专家来给自己或家人看病,但个人精力其实有限,往往难以面面俱到,医院病床、语言障碍、签证时间不够等难题都是患者和家属要克服的阻碍。唯安国际医疗开通香港医院绿色通道帮助大陆患者顺利就医,大陆患者选择赴港就医前,唯安国际医疗可以帮助大陆患者获得更多就医资讯,免费咨询热线:00852-60660160
一键免费通话 在线免费咨询
上一篇:乐伐替尼/乐卫玛与索拉非尼相比具有成本效益
下一篇:索拉非尼/甲苯磺酸索拉非尼片治疗肝移植术后复发性肝癌

相关资讯